紫外可見分光光度計的光學系統簡介

紫外可見分光光度計的光學系統簡介
    分光光度計的光學系統有許多類型，不同類型的光學系統，對測量方法和結果都有一定影響，下面，我們介紹幾種常用分光光度計的光學系統。
（－）單光束光學系統：它是分光光度計中最簡單的和應用最普遍的一種。它的特點是只有一條光束。通過交換參比和樣品的位置，使其分別進入光路。在參比（溶劑）進入光路時，調零。然后將樣品進入光路的信號和參比信號進行比較，就可在顯示器上讀出樣品的透過率和吸光度。結構如圖1所示。

 單光束分光光度計由于在每個波長都需要變換參比和樣品的位置，所以只能手動，不能掃描吸收光譜。它的結構比較簡單，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印裝置，則對一些常規的定量測定（如醫院化驗室）還是比較適用的。
    國產754型、WFD－SA型、WFZ800D型分光光度計，以及國外的貝克曼DU型、島津 QC－50、QR－50、日立 EPU－2A型、希爾格 H700型、C－4型等都屬于這種類型的儀器。
（二）雙光束光學系統：單光束分光光度計雖簡單價廉，但有如下缺陷：即它要求在整個測定過程中光源必須穩定不變；另外光電轉換器和放大器如有不規則的特性會給測量結果帶來誤差。為克服上述缺點，設計了雙光束分光光度計。其結構示意圖如圖2所示。 

 雙光束分光光度計的光路設計基本與單光束相似。差別在于雙光束分光光度計的單色器的出射狹縫和樣品室之間加了一個光束分裂器或斬波器，它的作用是以一定頻率把一個光束交替分成兩路。使一路經過參比溶液，另一路經過樣品溶液，然后由一個檢測器交替接收（或兩個匹配檢測器分別接收）參比信號和樣品信號。接收的光信號轉變成電信號后，由前置放大器放大，最后由顯示系統顯示透光度或吸光度。為了保持參考光路在不同的波長有恒定光電流輸出，常采用兩種設計方法： 
一種是采用光電倍增管，電壓恒定，但狹縫寬度隨波長而變化；另一種是采用狹縫寬度恒定，但光電倍增管電壓隨波長而變化。后者便于在相同測定條件下對一些數據進行比較，雙光束方式測定程序大大簡化，不僅可直接讀數、記錄結果和數字顯示，而且可進行“全波段自動掃描”，實現自動化分析，直接打印出分析結果，再加上附件的設置，更加擴展了它的使用范圍。因此雙光束分光光度計發展很快，使用更加普遍，比單光束分光光度計要優越得多。

（三）雙波長／雙光束分光光度計：由于單、雙光束分光光度計都不能克服因非特征吸收信號（如試液混濁引起的散射，比色皿-空氣界面與比色皿-溶液界面的折射差別等）的影響而帶來測量中的誤差。為此提出了雙波長測定法，用雙波長分光光度計來測定高濃度試樣的混濁試樣以及多組分混合物的定量分析具有很大的優越性，提高了靈敏度和準確度。

從圖3可知雙波長分光光度計的基本原理是：從同一個光源發出的光分成兩束，分別經過兩個單色器，得到兩束具有不同波長（λ1和λ2）的單色光，利用切光器使這兩束光以一定的時間間隔交替地照射到同一個試樣池。經過光電倍增管和電子控制系統，在記錄器上顯示出兩束光（λ1和λ2）的吸光度差⊿A，即⊿A=Aλ1－Aλ。只要λ1和λ2選擇得適當（被測物在一個波長上有最大吸收峰，在另一個波長上則不吸收或很少吸收；而非檢測物對兩種波長的吸收是相同的），⊿A就為消除了非特征吸收影響（或稱扣除了“背景吸收”）的吸光度。

如圖4所示，設在雙波長測定中，入射到試樣池的兩束光強度相同，對應波長分別為λ1和λ2，其中AS為背景吸收，則有Aλ1＝K1CL＋AS1  Aλ2＝K2CL＋AS2若λ1和λ2選擇適當，則可認為 AS1= AS2= AS，即背景吸收相同，這樣透過試樣池的兩束光的吸光度差值為?⊿A= Aλ1－Aλ2=（K1－K2·CL  ⊿A= Aλ1－Aλ2=（K1－K2·CL
從上式可看出：⊿A與被測組分的濃度C成正比。這就是雙波長分光光度法定量分析的依據。 
下面以吸收點法測定二組分混合物中單個組分的含量為例，說明雙波長分光測定的特點。如圖4所示，圖中A為干擾組分的吸收光譜；B為待測組分的吸收光譜；C為A和B的混合物的吸收光譜。選擇A組分顯示相等吸光度的兩個波長λ1和λ2，則不管A組分濃度如何變化⊿A= Aλ1－Aλ2=0因此測定混合物C在λ1和λ2的吸光度差值，實際上就是B組分在λ1和λ2的吸光度差。由此可直接求得B組分的含量。
    這里必須指出：根據吸收曲線選擇λ1和λ2時，應滿足以下兩個基本條件，即干擾組分在這兩個波長應具有相同的吸光度，使干擾組分濃度的變化不影響測量值。其次，被測組分在這兩個選定波長的吸光度差值應足夠大，以便有足夠的靈敏度。
 從上述分析可看出，雙波長分光光度計有很多優點。首先它不用參比溶液，只用一個待測溶液，完全扣除了背景噪聲的干擾，也大大提高了測定的準確度，可用于微量成分的測定；其次可用于相互有干擾的多組分混合物中，不經分離可直接進行各組分的分析。對于生物材料、醫藥、食品等試樣的分析具有特殊重要意義。